人血小板衍生生長因子 PDGF ELISA試劑盒

　　人血小板衍生生長因子 PDGF ELISA試劑盒

　　免疫測定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何的診斷試劑離不開的原料，如抗原，酶等。以前用于免疫測定的抗原通常為各種純化抗原，而則為純化抗原免疫動物后獲得的多克隆和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆，而抗原或的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過各種化學(xué)合成方法制備。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或及其酶結(jié)合物等免疫測定試劑已成為現(xiàn)實的新一代試劑，各種新型使用的測定方法也不斷出現(xiàn)。

　　HBsAg試劑特點(檢測模式:臨床夾心法):包被為山羊多抗。多抗具有高親和性和對抗原各種表位的反應(yīng)性。酶表為與HBsAg有不同結(jié)合位點的鼠復(fù)合單位，可測得HBsAg變異樣品，提高檢測的特異性(99.98%)提高檢測的靈敏度，應(yīng)用Parl Ehrich 學(xué)說(PEI)HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品，對ad標(biāo)準(zhǔn)品的靈敏度為0.05ng/ml對ay標(biāo)準(zhǔn)品靈敏度為0.025ng/ml

　　ELISA檢測試劑盒應(yīng)用定性夾心免疫檢測技術(shù)，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條，這些多肽是型HEV核心氨基酸序列中抗原性很強(qiáng)的肽段，分別來自于該的開放閱讀框2和開放閱讀框3。將樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM，這些就會與HEV 的多肽抗原結(jié)合，并固定在上面，洗板除去其它非特異性和樣品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP(辣根過氧化物酶)酶結(jié)合物，經(jīng)第二次孵育后，酶結(jié)合物就會與次孵育結(jié)合上的HEV IgM相結(jié)合，洗板除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時會發(fā)生酶-底物反應(yīng)，只有那些含有HEV IgM和酶結(jié)合物所形成的復(fù)合物的孔才會發(fā)生顏色變化，加入溶液終止酶和底物間的反應(yīng)，并在波長: 450nm處測量O.D.值,按照本HEV IgMelisa試劑盒的測試標(biāo)準(zhǔn), O.D.值大于或等于Cut-Off值的樣品被認(rèn)為是初試陽性。

　　用途

　　ELISA的基礎(chǔ)是抗原或的固相化及抗原或的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本(測定其中的或抗原)與固相載體表面的抗原或起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定。

　　然而，影響Elisa試驗結(jié)果的因素很多，故加強(qiáng)各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點。

　　特點

　　一、、靈敏、特異的;

　　二、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性;

　　三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體;

　　四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標(biāo)本類型;

　　五、節(jié)省實驗經(jīng)費(fèi)。

　　elisa試劑盒回收率是反應(yīng)待測物在樣品分析過程中的損失的程度，損失越少，回收率越高，如果作標(biāo)液1PPM，就是1毫克/升，而作出標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)為0.99毫克/升，就是說你的回收率是99%，這個與真實成分有密切的關(guān)系，說明方法的準(zhǔn)確度。比如水中總無機(jī)氯含量測定，樣品水中含有無機(jī)氯20mg/L，取100mL被測水樣品，加入0.1mL濃度為10mg/mL的含無機(jī)氯標(biāo)準(zhǔn)樣品，測定時忽略體積變化，如果測定出樣品中無機(jī)氯為29.8mg/L，則認(rèn)為回收率為99%。

　　制備方法

　　包括以下步驟:

　　1)抗原表位的計算機(jī)篩選;

　　2)抗原的制備;

　　3)血清的采集;

　　4)間接ELISA方法的建立;

　　5)間接ELISA方法的敏感性和特異性驗證;

　　6)試劑盒的穩(wěn)定性驗證;

　　7)對屠宰場進(jìn)行臨床檢測。該方法簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性合格、重復(fù)性好。應(yīng)用本發(fā)明制得的試劑盒能有效檢出感染豬的戊型肝炎病毒，適用于大批量發(fā)病樣本的檢測，可用于豬戊肝的快速診斷，并預(yù)防、控制豬戊肝病毒的流行和阻斷戊肝病毒由豬向人傳播。

　　組成結(jié)構(gòu)

　　1、 血清:操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細(xì)胞迅速小心地分離。

　　2、 血漿:EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

　　3、 細(xì)胞上清液:1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

　　4、 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。

　　5、 保存:如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

　　此IBL試劑盒能用于小鼠血清,EDTA血漿,細(xì)胞上清中白介素-6的定量檢測

　　試劑盒成分

　　1 預(yù)包被板: 抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 96T

　　2 酶標(biāo)記: (30倍濃縮)HRP標(biāo)記抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 0.4mL x 1

　　3 標(biāo)準(zhǔn)品: 重組小鼠白介素-6 0.5mL x 2

　　4 EIA緩沖液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1

　　5 標(biāo)記稀釋液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1

　　6 顯色劑: TMB底物液 15mL x 1

　　7 終止液: 1N 12mL x 1

　　8 濃縮洗滌液: (40倍濃縮) 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1 操作說明 1實驗所需器材(但試劑盒沒有提供) 酶標(biāo)儀(450nm) 微移液管及其吸嘴 量筒及燒杯 去離子水 冰箱(4°C) 坐標(biāo)紙(log/log) 吸水紙 試管(用于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋) 溫育箱(37°C ± 1°C) 洗瓶 (用于洗板) 一次性試劑管(用于濃縮酶標(biāo)記和顯色劑)

　　操作方法

　　雙夾心法

　　1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。

　　2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

　　3. 加酶標(biāo):于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小時，洗滌。

　　4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10~30分鐘。

　　5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M0.05ml。

　　6. 結(jié)果判定:可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以"+"、"-"號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

　　間接法

　　1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜;

　　2.次日洗滌3次;

　　3.加一定稀釋的待檢樣品(未知)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌;

　　4.(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二(抗)0.1ml;

　　5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌;

　　6.'一遍用DDW洗滌。

　　其余步驟同"雙夾心法"的4、5、6。

　　發(fā)展前景

　　臨床測定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展，而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步更新和型標(biāo)記物的應(yīng)用。分子生物學(xué)正在并最終肯定會讓對整個生命科學(xué)有一個而的認(rèn)識，其對免疫測定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的，對以前一些難以檢測的生物活性物質(zhì)的測定，并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。

　　主要設(shè)備

　　試劑

　　(1) 包被緩沖液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液):

　　Na2CO3 1.59克

　　NaHCO3 2.93克

　　加蒸餾水至1000ml

　　(2) 洗滌緩沖液(PH7.4PBS):0.15M

　　KH2PO4 0.2克

　　Na2HPO4·12H2O 2.9克

　　NaCl 8.0克

　　KCl 0.2克

　　Tween-20 0.05% 0.5ml

　　加蒸餾水至1000ml

　　(3) 稀釋液:

　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

　　加洗滌緩沖液至100ml

　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5~10%使用。

　　(4) 終止液(3M H2SO4):

　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃(98%)21.7ml。

　　(5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):

　　0.2MNa2HPO4(28.4克/L)25.7ml

　　0.1M檸檬酸(19.2克/L) 24.3ml

　　加蒸餾水50ml。

　　(6) TMB(四甲基聯(lián))使用液:

　　TMB(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml

　　底物緩沖液(PH5.5) 10ml

　　0.75%H2O2 32μl

　　(7) ABTS使用液:

　　ABTS 0.5mg

　　底物緩沖液(PH5.5) 1ml

　　3%H2O2 2μl

　　(8) 抗原、和酶標(biāo)記。

　　(9) 正常人血清和陽性對照血清。

　　器材

　　(1) 聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

　　(2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

　　(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

　　試驗原理

　　試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將生物素標(biāo)記的同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關(guān)系。

　　自備材料

　　1. 蒸餾水。

　　2. 加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

　　3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

　　安全性

　　1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

　　2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

　　3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

　　4. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

　　5. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

　　6. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

　　7. 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

　　8. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

　　9. 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

　　10. 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

　　11. 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

　　12. 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

　　測試要求

　　做好對照

　　正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　　實驗條件的選擇

　　在ELISA中，進(jìn)行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

　　(1) 固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被，在同一實驗條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

　　(2) 包被(或抗原)的選擇:將(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18~24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1~10μg/ml。

　　(3) 酶標(biāo)記工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記部份)。然后再固定其它條件或采取"方陣法"(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

　　(4) 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

　　分裝:

　　檢測范圍和靈敏度不同，用量少時，可使用分裝，前期是它的長久性不是很好。

　　試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線點OD 值均在2.0±0.2，零孔的OD 值都控制在0.10以下。

　　試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R≥0.98。

　　試劑盒重復(fù)性好，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均試劑的組份都多給20%的富余量，確保完成48/96孔的檢測，避免分次檢測可能造成試劑量不足的情況。

　　檢測及酶結(jié)合物的稀釋度合適(均為1:30), 方便試驗操作者準(zhǔn)確地做稀釋工作，保證實驗結(jié)果的重復(fù)性。

　　白介素6是一種細(xì)胞因子,已被證實為B細(xì)胞分化因子.它是一種形成系統(tǒng),它的生理特性,如肝細(xì)胞急性蛋白合成的誘導(dǎo)和基于和白介素3協(xié)同作用的生長刺激等,也備受關(guān)注. 并且已證實白介素-6與病理學(xué)存在穩(wěn)定的相關(guān)關(guān)系.例如,報道多種疾病的生長因子為白介素-6, 骨髓瘤細(xì)胞能合成白介素-6并表達(dá)白介素-6受體.此外, 白介素6在多種炎性疾病和自身免疫疾病發(fā)揮重要的作用. 此試劑盒能高靈敏度的檢測小鼠血清和細(xì)胞基質(zhì)上清的白介素6 原理 此試劑盒運(yùn)用了兩種特異性,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強(qiáng)度與小鼠的白介素-6的量成正比. 檢測范圍 10.94的 700 pg/mL 預(yù)期用途

　　人血小板衍生生長因子 PDGF ELISA試劑盒 應(yīng)用領(lǐng)域

　　ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測定，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，

　　可概括四個方面:

　　1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。

　　2、研究抗酶的合成。

　　3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。

　　4、定量檢測體液中抗原或成份。

　　注意事項

　　ELISA試劑盒檢測過程中的注意事項

　　一、ELISA實驗通用規(guī)則

　　1、要保證移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進(jìn)行確定。但有人員進(jìn)行矯正。

　　2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時。

　　3、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。

　　4、實驗時，要使底物避光保存。

　　5、用槍吸取液體時速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。

　　6、吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

　　7、將液體加到酶標(biāo)孔中時，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會自然流下去。

　　8、液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動功能。

　　9、溫浴時，要用不干膠或膠帶紙封好酶標(biāo)板，防止水分的蒸發(fā)。

　　10、洗板時，每次洗液加入后，應(yīng)靜置1分鐘，使清洗更加。沒有洗板機(jī)時，倒去液體后，要將酶標(biāo)板在報紙或毛紙上用力拍干。

　　11、洗液不夠時，可用蒸餾水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸緩沖液，加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長期保存。

　　12、底物是光敏感的，要在臨用前現(xiàn)配。

　　13、檢測前，要打開酶標(biāo)儀，使之穩(wěn)定10分鐘以上。

　　14、底物有一定的毒性，終止液對皮膚有腐蝕性，應(yīng)盡量避免接觸。

　　15、待檢樣品要澄清，否則會影響結(jié)果。

　　16、溫浴時間應(yīng)遵守試劑盒規(guī)定。

　　17、應(yīng)盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

　　18、對結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。