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大鼠丙二醛(MDA)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明

來源:本生(天津)健康科技有限公司   2024年08月19日 09:32  

  大鼠丙二醛(MDA)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明

  本試劑僅供科研使用

  實驗目的:

  本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中丙二醛(MDA)的含量。

  實驗原理:

  本試劑盒應采用雙抗體夾心法測定標本中大鼠丙二醛(MDA)水平。用純化的丙二醛(MDA)捕獲抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被的微孔中依次加入丙二醛(MDA),再與HRP標記的檢測抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的丙二醛(MDA)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中丙二醛(MDA)含量。

  試劑盒組成:

  試劑盒組成48孔配置96孔配置保存

  說明書1份1份

  封板膜2片2片

  密封袋1個1個

  酶標包被板1×481×962-8℃保存

  標準品0.3ml×6管0.3ml×6管2-8℃保存

  酶標試劑5 ml×1瓶10 ml×1瓶2-8℃保存

  樣品稀釋液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

  顯色劑A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

  顯色劑B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

  終止液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

  20×濃縮洗滌液15ml×1瓶25ml×1瓶2-8℃保存

  樣本處理及要求:

  1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應再次離心。

  2. 血漿:應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。

  3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

  4. 細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

  5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

  6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融。

  7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

  操作步驟

  1. 標準品的加樣:設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。

  2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

  3. 加酶:每孔加入酶標試劑100μl,空白孔除外。

  4. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。

  5. 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

  6. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

  7. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘。

  8. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

  9. 測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

  計算:

  以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。

  注意事項:

  1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘。

  2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。

  3. 各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

  4. 請每次測定的同時做標準曲線,最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。

  5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

  6. 底物請避光保存。

  7. 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

  8. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

  9. 本試劑不同批號組分不得混用。

  技術提示:

  1、混合蛋白溶液時,避免起泡。

  2、加校準品與樣本時,每個校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭,公共組分應該懸臂加樣,避免交叉污染。

  3、合適的溫育時間,和充分的洗滌步驟,是保證實驗結(jié)果準確性的必要條件。

  4、底物溶液為無色液體,保存過程中變?yōu)樗{色,代表底物溶液已經(jīng)失效,不得使用。

  5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,加入終止液后,藍色底物產(chǎn)物,會瞬間變?yōu)辄S色。

  6、實驗中,用剩的板條,應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

  7、所有液體組分,使用前充分搖勻,嚴格按照說明書標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

  8、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定,嚴格防止交叉污染,所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進行處置。

  試劑盒性能:

  1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.95以上。

  2. 批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應分別小于10%和15% 。

  保存條件及有效期:

  1. 試劑盒保存: 2-8℃。

  2.有效期: 6個月

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