單細胞分析的重要性
日益成熟的蛋白組學技術(shù)發(fā)展到今天，研究人員不斷提出新的需求，其中單細胞蛋白組分析稱得上是其中的大熱門。應用單細胞技術(shù)，我們可以研究極低樣品量的樣品，可以對比異質(zhì)性的細胞或者組織，可以尋找細胞分化、胚胎發(fā)育過程中的變化。但同樣我們也意識到，其最大的研究難點都集中在這個“單”字，意味著我們的研究對象含量極低，不能使用常規(guī)的方法進行處理，分析的手段也必須具備更高靈敏度；同樣的，單個細胞的分析會很大程度增加需要分析的樣品數(shù)目，通量的重要性也必須考慮。
說到這，去年賽默飛在 ASMS 上發(fā)布的全新一代 Orbitrap Astral 質(zhì)譜儀，兼具高通量高靈敏度深度覆蓋的特點于一身，實在是非常好的單細胞蛋白組分析“食用”利器。那么各位單細胞蛋白組的愛好者們，請不要錯過接下來的這份 Orbitrap Astral “食譜”，獲得單個 Hela 細胞中5000-6500+ 的蛋白鑒定，帶你“品嘗”單細胞的世界。
Orbitrap Astral TSCP(turbo single cell proteomics) 整體解決方案
來自丹麥的科研人員在bioRxiv 預印本上發(fā)表了最新的基于 Astral 的單細胞蛋白組分析的文章，可以 40 SPD 的通量在單個 Hela 細胞中獲取超過 5000 個蛋白鑒定[1]。因此，我們首先進行了一系列的驗證工作，確定該方案的性能表現(xiàn)，接著嘗試著做了一些改變，完善整體解決方案。
40SPD，單個 Hela 細胞超過5000 個蛋白鑒定[1]
01 單細胞分離
第一步我們需要獲取單細胞，而其獲取方式也有好幾種，例如流式細胞儀分選，微流控技術(shù)、cellenONE、激光輔助顯微切割等。這次我們選用了 cellenONE 體系進行單細胞分離，但如果各位使用其它的方案分離單細胞，或者使用一些比較大的單細胞，例如卵細胞等，可以從第二部分 “單細胞蛋白組樣品前處理” 開始閱讀，同樣適用。
我們選擇了 Hela 細胞作為分析對象，分別分離了單個細胞，10個細胞和20個細胞進行后續(xù)的分析。
Hela 單細胞分離
02 單細胞蛋白組樣品前處理
由于單個細胞蛋白含量極低，其中單個 Hela 細胞約含 150-600 pg 總蛋白，因此在進行樣品前處理時，需要控制反應體系，保證其酶解效率。我們在流程驗證中使用了與文獻1一致的 proteoCHIP，并在后續(xù)嘗試使用不同的孔板，96 或 384 孔板的形式，盡可能控制反應體系的大小。
樣品前處理過程[2]如下所示，步驟依次為加入酶解液，分選細胞，孵育，以及根據(jù)所使用的 proteoCHIP 或者孔板，將樣品轉(zhuǎn)移至 evotip 后上樣或者直接上樣。
單細胞蛋白組樣品前處理過程
但如果各位使用其它的方案進行樣品前處理，例如使用一些比較大的單細胞，卵細胞時使用 PCR管控制反應體系進行處理，可以從第三部分 “LC-MS 分析” 開始閱讀，同樣適用。
03 LC-MS 分析
不同于常規(guī)上樣量的分析方法，單細胞蛋白組中通常需要優(yōu)化色譜與質(zhì)譜條件使其更符合低上樣量的樣品，包括但不限于更低的液相流速、使用 FAIMS Pro，延長二級離子注入時間等條件。通常，可以使用稀釋的肽段樣品，模擬單細胞樣品上樣量獲取優(yōu)化的分析條件，也可將該樣品作為整個流程的質(zhì)控樣品，檢測系統(tǒng)狀態(tài)。
如圖所示，F(xiàn)AIMS Pro 接口可有效去除背景噪音，從譜圖中可觀察到更多的肽段信號，可提高整體的鑒定深度，更有利于少量樣品的分析。因此在后續(xù)分析中均使用了 FAIMS Pro 接口。
單細胞樣品的 BPC 圖對比，不加和加載 FAIMS Pro
我們使用稀釋的 Hela 肽段進行色譜與質(zhì)譜方法的優(yōu)化，結(jié)果下圖所示。250 pg Hela 肽段可獲得近 6000 蛋白鑒定，近45000 肽段，與文獻報道一致[3]，確證系統(tǒng)狀態(tài)正常。
Hela 肽段不同稀釋上樣量的蛋白和肽段鑒定結(jié)果，數(shù)據(jù)分析使用 directDIA，不同上樣量的樣品之間不做合并分析
04 Orbitrap Astral 單細胞蛋白組分析性能展示
流程驗證結(jié)果：40SPD 時，單個 Hela 細胞可獲得 5000+ 蛋白鑒定
首先，我們進行了流程驗證，將處理后的單細胞，10個細胞和 20 個細胞樣品分別上樣，結(jié)果如上圖所示。使用與文獻1一致的流程，通量 40 SPD 時，Orbitrap Astral在單個 Hela 細胞中可獲得 5000+ 蛋白鑒定，與文獻報道結(jié)果一致，確證了該單細胞蛋白組分析方案的可行性及儀器性能的穩(wěn)定性。
接著，我們在此基礎上，進行了一些改變，使用兼容性孔板進行單細胞分離，進行樣品前處理后可直接放置在 Vanquish Neo 液相系統(tǒng)中上樣，使用 60 SPD 的方法，結(jié)果可在單個細胞中獲得6500+ 蛋白鑒定。
Vanquish Neo + Astral，60SPD 時，單個 Hela 細胞可獲得 6500+ 蛋白鑒定
需要我們注意的是，即使是同樣的 Hela 細胞，不同實驗室、不同傳代次數(shù)、不同直徑大小、等等因素都會影響到最終的單細胞蛋白組分析結(jié)果。
另外，如果考慮進一步通量的提高，也可以嘗試使用 TMT 等多重通道標記試劑的方法。
Orbitrap Astral單細胞蛋白組分析 “食譜”(整體解決方案)
使用 Orbitrap Astral，單個 Hela 細胞可獲得中5000-6500+ 的蛋白鑒定，每天完成 60個單細胞數(shù)據(jù)采集，兼顧靈敏度與通量，Turbo speed 實現(xiàn)高通量，Turbo sensitivity 實現(xiàn)超高鑒定深度。各位單細胞蛋白組的愛好者們，收好這份單細胞蛋白組分析“食用”指南，一起品嘗單細胞的世界。
參考文獻
[1] Zilu Ye, Pierre Sabatier, Leander van der Hoeven, Teeradon Phlairaharn, David Hartlmayr, Fabiana Izaguirre, Anjali Seth, Hiren J. Joshi, Dorte B. Bekker-Jensen, Nicolai Bache, Jesper V. Olsen. High-throughput and scalable single cell proteomics identifies over 5000 proteins per cell, bioRxiv preprint doi
[2] proteoCHIP EVO 96 flyer
[3] Julia A. Bubis, Tabiwang N. Arrey, Eugen Damoc, Bernard Delanghe, Jana Slovakova, Theresa M. Sommer, Harunobu Kagawa, Peter Pichler, Nicolas Rivron, Karl Mechtler, Manuel Matzinger. Challenging the AstralTM mass analyzer — going beyond 5200 proteins per single-cell at unseen quantitative 1 accuracy to study cellular heterogeneity, bioRxiv preprint doi.
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