?。?)PCR法Smith等針對(duì)豬鏈球菌主要致病菌株利用莢膜生物合成基因的DNA序列特性建立了血清型特異性PCR鑒定方法。他們?cè)O(shè)計(jì)了3對(duì)引物:
CPS2Jprimers5’-CAAACGCAAGGAATTACGGTATC-3’,
CPS1Iprimers5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’
CPS9Hprimers5’-GGCGGTCTAGCAGAATGCTCG-3’,
利用CPS-J引物進(jìn)行PCR鑒定,可以檢測(cè)出2型和1型或2型;利用CPSlI引物進(jìn)行PCR鑒定,可以檢測(cè)出1型和14型;利用CPS9H引物進(jìn)行尸CR鑒定,可以檢測(cè)出9型。
馬清霞、何孔旺、陸承平等根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成引物,建立了能同時(shí)檢測(cè)豬鏈球菌2型(cps)及其重要毒力因子溶菌酶釋放蛋白(mrp)和細(xì)胞外因子(印f)的多重PCR方法。目的片段的大小分別885bp(mrp)、675bp(cps)和443bp(epf)。對(duì)參考菌株、人工攻毒病料和臨床收集病料的檢測(cè)結(jié)果顯示,該多重PCR法特異性強(qiáng)、敏感性高,可直接從臨床病料中檢測(cè)出豬鏈球菌2型i并能鑒定其毒力因子表型。
倪艷秀等(2002)根據(jù)豬鏈球菌2型的莢膜多糖抗原基因cps-j,合成1對(duì)可擴(kuò)增長(zhǎng)度為675bp目的片段的引物,對(duì)9株經(jīng)玻片凝集試驗(yàn)檢測(cè)為豬鏈球菌2型的菌株進(jìn)行了檢測(cè),均呈陽(yáng)性;同時(shí),用此法對(duì)88份正常豬的扁桃體樣品的細(xì)菌分離物進(jìn)行了檢測(cè),36份呈陽(yáng)性;同時(shí)用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照檢測(cè),36份也呈陽(yáng)性。此法不需進(jìn)行細(xì)菌的純分離培養(yǎng),即可用于豬鏈球菌2型的快速診斷以及流行病學(xué)調(diào)查,特異性強(qiáng)。
何孔旺等用PCR方法檢測(cè)2型豬鏈球菌兩種毒力因子(MRP和EF),其檢測(cè)的敏感度可達(dá)100個(gè)細(xì)菌。他們用建立的PCR對(duì)從病豬體內(nèi)分離的菌株進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)的15株2型分離株中有13株MRP和EF,均呈陽(yáng)性,為典型的高毒力表型菌株(MRP+EF+),其余1株為MRP+EF-,1株為MRP-EF-。
?。?)豬鏈球菌做隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分型研究寧宏波等利用100條10聚核苷酸隨機(jī)引物對(duì)分離的20株豬鏈球菌做隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分型研究,有27條引物呈現(xiàn)良好的多態(tài)性和穩(wěn)定性,產(chǎn)生穩(wěn)定、復(fù)雜的指紋圖譜。通過(guò)SPASS10.0軟件分析了不同菌株之間的遺傳距離,把20株豬鏈球菌分成4個(gè)聚類(lèi)群。從分子水平上確立了該病的流行病學(xué)調(diào)查方法,同時(shí)為該病的防治提供了理論依據(jù)。
(3)豬鏈球菌熒光PCR快速檢測(cè)方法由北京檢驗(yàn)*和中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所共同研制成功的豬鏈球菌熒光PCR快速檢測(cè)技術(shù)(2006),具有快速、敏感、特異、安全等顯著優(yōu)點(diǎn),此檢測(cè)技術(shù)將檢測(cè)時(shí)間縮短為1.5h。此方法的問(wèn)世,為我國(guó)開(kāi)展豬鏈球菌檢測(cè)提供了。該技術(shù)不僅可用于活豬檢測(cè),還可用于豬肉及其產(chǎn)品的檢測(cè)。
同時(shí),于新和等利用自制熒光抗體進(jìn)行鏈球菌病的診斷,可在2~3h內(nèi)對(duì)鏈球菌作出診斷,比直接鏡檢具有更好的特異性和敏感性。