近期，福建省水產(chǎn)研究所陳貝博士研究團(tuán)隊(duì)與廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)共同在《BMC complementary and alternative medicine》上發(fā)表了題為“Photoprotective effects of Sargassum thunbergii on ultraviolet B-induced mouse L929 fibroblasts and zebrafish"的研究論文。

本項(xiàng)目研究由環(huán)特生物提供斑馬魚實(shí)驗(yàn)支持，該研究通過L929細(xì)胞與斑馬魚模型評(píng)價(jià)馬尾藻對(duì)紫外線B誘導(dǎo)光損傷的保護(hù)作用，旨在探討馬尾藻乙醇提取物的光保護(hù)效應(yīng)。

當(dāng)前，隨著人們生活水平的逐步提升,人們對(duì)延緩皮膚衰老的需求愈加強(qiáng)烈,保護(hù)皮膚的意識(shí)也逐漸提高。皮膚是人體與外界環(huán)境隔離的第一道屏障。持續(xù)暴露于紫外線B（UVB），可通過改變與炎癥、氧化應(yīng)激和DNA損傷相關(guān)的信號(hào)通路，引發(fā)急性或慢性的皮膚失調(diào)、損傷、皮膚癌和皮膚老化等皮膚病變。如何預(yù)防皮膚暴露UV或緩解皮膚UV損傷,從而延緩皮膚光老化日益受到人們的關(guān)注。

海藻具有豐富的生物活性化合物，具有抗氧化和抗感染的特性。通過制備馬尾藻富含酚提取物（STPE），用L929成纖維細(xì)胞和斑馬魚評(píng)價(jià)其抗UVB損傷的活性。用40%乙醇和大孔樹脂XDA-7提取并純化STPE。分析活性氧（ROS）和抗氧化標(biāo)志物，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。通過炎癥細(xì)胞因子基因和蛋白表達(dá)確定STPE對(duì)UVB誘導(dǎo)炎癥的影響；通過蛋白印跡法測(cè)定核因子-κB（NF-κB）通路中信號(hào)分子的表達(dá)；通過Hoechst 33342染色法分析并觀察DNA凝聚情況；通過斑馬魚模型尾鰭面積和 ROS測(cè)量進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)。

結(jié)果：STPE的總多酚含量為72%，STPE降低了L929細(xì)胞中的ROS含量，提高了SOD和CAT活性，顯著降低了MDA含量，從而有效緩解了UVB輻射誘導(dǎo)的氧化損傷。STPE抑制TNF-α、IL-6和IL-1α的mRNA和蛋白表達(dá)。與UVB對(duì)照相比，STPE在濃度為20和40μg/mL時(shí)逆轉(zhuǎn)了DNA凝聚。此外，STPE抑制UVB照射后L929細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路的激活，減輕DNA凝聚。1.67μg/mL STPE顯著增加了斑馬魚尾部fn面積，0.8-1.6μg/mLSTPE顯著消除了UVB輻射后過量的ROS。

結(jié)論：STPE通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路，抑制UVB誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎性細(xì)胞因子表達(dá)和DNA凝聚，表明它可以防止UVB誘導(dǎo)的光損傷，并具有用于皮膚病治療的臨床開發(fā)潛力。

● 綜述

在不被臭氧層吸收的紫外線 (UV) 類型中，紫外線 B (UVB)（波長(zhǎng) 280-315 nm）是皮膚損傷發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素。

UVB的波長(zhǎng)較短,比UVA (320–400 nm) 的能量強(qiáng)30-40倍。許多皮膚病，如癌癥、光老化、曬傷和色素沉著，都與 UVB 暴露密切相關(guān)。由于其波長(zhǎng)較短，UVB主要被表皮吸收；然而，它也可以穿透該皮膚層到達(dá)真皮并影響成纖維細(xì)胞的生理功能。對(duì)紫外線照射皮膚或真皮成纖維細(xì)胞的研究主要集中于DNA突變、炎癥和光老化。

海洋生物可通過物理或化學(xué)的阻隔作用、抗氧化、色素的抑制作用以及核酸和蛋白的修復(fù)功能等多種生理和生化防御機(jī)制，減少UV輻射對(duì)自身造成的損害。新近，由于皮膚健康行業(yè)對(duì)抗衰老、抗過敏和美白天然產(chǎn)品的需求不斷增長(zhǎng)，海洋生物活性物質(zhì)逐漸被應(yīng)用于抗光老化化妝品的開發(fā)中,例如海洋多酚、海洋多肽、海洋多糖、海洋類胡籮ト素、海洋萜類化合物等，這些生物活性物質(zhì)通常可通過多種光保護(hù)機(jī)制共同作用，緩解UV輻射對(duì)皮膚的傷害。

從腔昆布(E.cava)中提取的褐藻多酚、鵝掌菜酚和二鵝掌菜酚均可降低UVB輻射后細(xì)胞內(nèi)ROS含量，孵育褐藻多酚后細(xì)胞活力呈劑量依賴性增加,DNA損傷也顯著減少；從鐵釘菜（Ishige okamurae）中提取的褐藻多酚DPHC通過降低細(xì)胞內(nèi) ROS 水平、減少受損的DNA尾部長(zhǎng)度，引起成纖維細(xì)胞形態(tài)變化，對(duì)UVB輻射具有強(qiáng)大的保護(hù)特性。

在過去的幾十年中，海藻一直是天然產(chǎn)品的重要來(lái)源，可用于尋找具有藥理和營(yíng)養(yǎng)特性的新化合物。黑藻是一種重要的經(jīng)濟(jì)褐藻，分布于中國(guó)和日本海域，含有許多生物活性化合物，如吲哚衍生物、吲哚酮生物堿、醌衍生物、多酚和多糖。S. thunbergii生活在潮間帶，由于潮汐變化而發(fā)生多種變化，包括高太陽(yáng)輻照度、干燥、鹽度和溫度的變化。因此，我們推測(cè)，黑曲霉中的酚類化合物可能具有紫外線防護(hù)活性。然而，據(jù)我們所知，桑伯格鏈球菌的光保護(hù)活性以前從未報(bào)道過。

據(jù)報(bào)道，小鼠 L929 成纖維細(xì)胞系是一種用于藥物/化學(xué)品光毒性評(píng)估的、有效的體外篩選測(cè)試系統(tǒng)。斑馬魚（Danio rerio），被越來(lái)越多地視為評(píng)價(jià)UVB保護(hù)化合物對(duì)鰭損傷和ROS生成的一種不錯(cuò)的功效評(píng)價(jià)模型。本研究中，我們建立了一個(gè)暴露于UVB 的L929細(xì)胞和斑馬魚光損傷模型，以研究S. thunbergii富含酚類提取物 (STPE) 的 UVB 光保護(hù)活性。

● 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 STPE對(duì)斑馬魚生長(zhǎng)的影響

收集受精后 2 天 (dpf) 發(fā)育的 AB 野生型斑馬魚胚胎，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為 30 個(gè)胚胎。胚胎用濃度為 5、10、25、100、250、500、1000 和 2000 μg/mL 的 STPE 處理 24 小時(shí)，并暴露于紫外線治療儀。UVB 暴露后，所有胚胎以 5 dpf 計(jì)數(shù)存活率。

1.2 STPE對(duì)UVB照射斑馬魚尾鰭損傷的修復(fù)作用

收集在 2 dpf 發(fā)育的胚胎，用不同濃度的 STPE（0.56、1.67 和 5 μg/mL）處理胚胎 24 小時(shí)。從每組中隨機(jī)選擇10條斑馬魚在解剖顯微鏡下觀察它們的尾鰭，分析圖像以計(jì)算其尾鰭面積。尾鰭區(qū)域用于評(píng)估 STPE 對(duì)斑馬魚紫外線照射引起的皮膚損傷修復(fù)的影響。

1.3 STPE 對(duì) UVB 照射斑馬魚 ROS 清除的影響

收集在 2 dpf 發(fā)育的胚胎，用不同濃度的 STPE（0.8、1.2 和 1.6 μg/mL）或 EGCG（30 μg/mL）處理胚胎 24 小時(shí)。測(cè)量胚胎 (FI) 的熒光強(qiáng)度，STPE對(duì)斑馬魚氧自由基清除的影響計(jì)算如下：

● 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. STPE 逆轉(zhuǎn) UVB 誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降

用 40% 無(wú)水乙醇在 70°C 下提取S. thunbergii兩次，用大孔吸附樹脂 XDA-7 純化得到 STPE。使用比色法 Folin-Ciocalteu 方法測(cè)定 STPE 的總多酚含量為 72%。

為了確定 STPE 細(xì)胞毒性，L929 細(xì)胞用不同濃度的 STPE（0-320 μg/mL）處理 24 小時(shí)。與未處理組相比，濃度為 10-40 μg/mL 的 STPE 對(duì)細(xì)胞活力沒有影響（p  > 0.05；圖 1a），盡管在 80 μg/mL 時(shí)觀察到細(xì)胞毒性（p  < 0.05）。基于此，10–40 μg/mL STPE 用于后續(xù)測(cè)定。

用不同劑量的 UVB (0-320 mJ/cm 2 ) 處理細(xì)胞并培養(yǎng) 24 小時(shí)以確定誘導(dǎo)光損傷的適當(dāng)輻照劑量。UVB 以濃度依賴性方式降低細(xì)胞活力（圖1b）；20 兆焦耳/厘米2UVB 使細(xì)胞活力降低了大約 50%，并在隨后的實(shí)驗(yàn)中被選為 UVB 劑量。與實(shí)驗(yàn)對(duì)照相比，單獨(dú)暴露于 UVB 后，細(xì)胞活力降低至 60%（圖1c）。然而，用 STPE (10–40 μg/mL) 預(yù)處理細(xì)胞以濃度依賴性方式逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)，并且在 40 μg/mL 時(shí)與 UVB 模型組顯著不同。

圖1：STPE 可逆轉(zhuǎn) UVB 引起的細(xì)胞活力下降。( a ) STPE和( b ) UVB在不同濃度或劑量下對(duì)L929細(xì)胞活力的影響，以及( c ) STPE對(duì)UVB (20 mJ/cm 2 )對(duì)L929細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。帶有“*"的均值差異顯著（p ?< 0.05）

2. STPE 抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化

評(píng)估由UVB誘導(dǎo)的STPE對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的清除作用，測(cè)量STPE對(duì)UVB暴露產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)ROS的清除作用（圖2a）。與對(duì)照細(xì)胞相比，暴露于UVB的細(xì)胞中的ROS 水平增加了2.35倍。然而，用濃度增加的STPE對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24小時(shí)預(yù)處理，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS濃度依賴性降低。

圖2：STPE抑制UVB誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。STPE對(duì)L929細(xì)胞( a ) ROS和 ( b )MDA含量以及 ( c ) SOD和 ( d ) CAT活性的影響。帶有“*"的均值差異顯著（p  < 0.05）

SOD和CAT是重要的抗氧化酶，可保護(hù)組織免受氧化損傷。MDA產(chǎn)生用于評(píng)估由于氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化。通過測(cè)量SOD、CAT 和 MDA的水平來(lái)評(píng)估STPE的保護(hù)機(jī)制。與對(duì)照組相比，UVB暴露后SOD水平降低；然而，這被20和40μg/mL的STPE預(yù)處理所消除（圖2c）。在40μg/mL的STPE處理后，CAT活性升高（圖2d）。UVB ( p < 0.05 ) 誘導(dǎo)的MDA含量增加（圖2 b）被 40μg/mLSTPE預(yù)處理逆轉(zhuǎn)（p  < 0.05）。

3 STPE對(duì)UVB照射斑馬魚尾鰭損傷的修復(fù)作用

近年來(lái)，斑馬魚已被廣泛用作體內(nèi)氧化應(yīng)激模型，來(lái)研究紫外線輻射的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)方案的示意圖如圖3a所示 。本研究首先探討了 STPE 對(duì)野生型 AB 株斑馬魚生長(zhǎng)的影響，從而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供有關(guān)zui大安全 STPE 濃度的數(shù)據(jù)。在紫外線照射后，STPE在濃度為10μg/mL及以上時(shí)會(huì)導(dǎo)致高死亡率。5μg/mL STPE未觀察到明顯異常；因此，這是斑馬魚紫外線損傷模型中使用的zui大實(shí)驗(yàn)濃度。

圖3：評(píng)價(jià)STPE對(duì)UVB照射斑馬魚的光保護(hù)作用。使用受精后2天 (dpf) 的斑馬魚胚胎。a為本研究中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)方案的示意圖。b、c為UVB誘導(dǎo)的畸形鰭表型可以通過 STPE 減弱。d為STPE 對(duì)斑馬魚UVB誘導(dǎo)的 ROS產(chǎn)生的抑制作用。p值小于0.05的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義并用“*"表示。

STPE修復(fù)暴露于UVB輻射的斑馬魚皮膚損傷的潛力，如圖3b和c所示，斑馬魚的尾鰭暴露于紫外線輻射后表現(xiàn)出粗糙和起皺的表型。茶多酚對(duì)斑馬魚皮膚損傷的修復(fù)效果為29%，說明陽(yáng)性對(duì)照處理顯著修復(fù)了斑馬魚皮膚損傷。用0.56、1.67和5μg/mL 的STPE處理斑馬魚導(dǎo)致尾鰭面積，分別與對(duì)照模型相比，對(duì)皮膚損傷修復(fù)的影響分別為3%、24% 和 6%?？偟膩?lái)說，STPE 對(duì)斑馬魚皮膚損傷有顯著的恢復(fù)作用。

4 STPE對(duì)UVB輻射斑馬魚的ROS清除作用

STPE對(duì)斑馬魚中UVB介導(dǎo)的ROS誘導(dǎo)的影響如圖3d所示。UVB組熒光值為6271±264（p  <0.001），高于正常對(duì)照組（1169±124），表明模型建立成功。 與UVB組相比，30 μg/mL EGCG陽(yáng)性對(duì)照組（1122±39）的熒光值降低了82%（p <0.001）。STPE組在0.8、1.2 和 1.6μg/mL 濃度下的熒光值分別為 1818 ± 78、1834 ± 116 和 950 ± 30，此時(shí)與UVB組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS積累減少了 71、71 和 85%（p < 0.001)。這些發(fā)現(xiàn)表明，STPE 對(duì)斑馬魚模型中的 ROS 具有顯著的清除作用。

● 討論

本研究中，我們從S. thunbergii中分離出富含酚類的提取物，并在體外使用L929細(xì)胞、在體內(nèi)使用斑馬魚模型評(píng)估其對(duì)UVB誘導(dǎo)的光損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對(duì) UVB的保護(hù)作用是通過 STPE 的抗氧化、抗炎和抗凋亡能力來(lái)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的（如下圖 ）。這項(xiàng)研究有助于對(duì)STPE皮膚保護(hù)作用的理解。我們將繼續(xù)努力獲得一種高度純化和穩(wěn)定的STPE分子，以進(jìn)一步用作潛在的保護(hù)劑，以減少因UVB引起的皮膚損傷。