2022年1月25日，《自然》雜志發(fā)布一篇專欄文章《Seven technologies to watch in 2022》，基于基因編輯技術的診斷、完整版基因組、蛋白質結構解析、量子模擬、精確基因組調控、靶向基因療法、空間多組學等獲評“有望改變2022年科學進程的7大前沿技術"。

近年來，斑馬魚基因編輯技術在基因敲除、基因敲入、轉基因訂制及表觀遺傳修飾等方面的應用日益廣泛，為基因組研究、研發(fā)新的癌癥治療方法、攻克遺傳性疾病等提供了全新的研究切入點及應用方向，也讓我們見證著生物學上的突破對人類生命質量提高的巨大影響力。

環(huán)特生物，依托10余年的斑馬魚基因編輯經驗，深度挖掘、創(chuàng)新斑馬魚技術的應用場景，已為150多家單位提供斑馬魚基因敲入、敲除、敲降、定制轉基因技術服務及斑馬魚疾病模型開發(fā)等專業(yè)的基因編輯技術服務，累計完成350例以上基因編輯品系，測試超過1000個gRNA靶點，推動了諸多前沿基因功能研究取得了突破性進展，為斑馬魚基因編輯技術在更加廣泛的研究領域內的創(chuàng)新性應用奠定了堅實的技術基礎。

本期我們繼續(xù)為大家分享斑馬魚基因編輯服務案例之二——

● 服務案例6.H2S通過斑馬魚的NOS/NO途徑促進發(fā)育性腦血管生成

研究背景：硫化氫（H2S）與一氧化氮（NO）和一氧化碳一起被認為是氣體遞質家族的第三個成員。據(jù)報道，H2 S通過促進內皮細胞的生長、遷移和管狀結構的形成來誘導血管生成。這些研究是在細胞培養(yǎng)、小鼠基質凝膠栓試驗模型、大鼠傷口愈合模型或大鼠后肢缺血模型的條件下進行的。新近的體內研究表明H2S在肌肉血管生成中的生理重要性。然而，內源性H2S在發(fā)育過程中對腦血管生成的重要性尚不清楚。因此，我們旨在確定H2S在腦血管發(fā)育中的作用。

研究目的：確定H2S在腦血管發(fā)育中的作用。

研究方法：使用Cas9介導的基因編輯，敲除cbs和cth,損害斑馬魚幼魚的腦血管發(fā)育。緩慢釋放的H2S供體GY4137孵育可緩解cbs和cth變形劑的腦血管發(fā)育缺陷。對中腦血管網絡的定量分析表明，H2S在不影響腦血管系統(tǒng)拓撲結構的情況下促進血管生成。機械上，cbs和cth變形劑中的一氧化氮合酶2a（nos2a）表達和NO生成均降低。通過將cbs或cth-MO與全長斑馬魚nos2a mRNA共注射，nos2a的過度表達減輕了cbs和cth變體的腦血管發(fā)育缺陷。

研究結論：H2S通過斑馬魚體內NOS/NO途徑促進腦發(fā)育血管生成。

研究成果出處：Jiang, Weiqing et al. H2S promotes developmental brain angiogenesis via the NOS/NO pathway in zebrafish. 2021

● 服務案例7.非典型蛋白酶激活受體1（part1）調節(jié)斑馬魚的淋巴分化

研究背景：PAR家族，尤其是part1，是血管止血、血栓形成和炎癥的關鍵介質

研究目的：探索par1在斑馬魚胚胎淋巴分化調控中的作用。

研究方法：

（1）制備斑馬魚par1和gnai2a突變體；

（2）將par1突變體與Tg(lyve1b:dsRed;flk1:EGFP)系雜交標記靜脈血管和淋巴管出芽；

（3）通過WISH分析gnai2同源基因(gnai2a和gnai2b)在斑馬魚胚胎中的表達模式；

（4）在Tg(fli1a:EGFP)胚胎中使用抗prox1抗體進行54hpf的免疫染色實驗

研究結論：mmp13b-par1-gnai2a軸通過促進Vegfc/Flt4/Erk1/2信號通路調控斑馬魚淋巴管生成過程。

研究成果出處：Daoxi Lei,Xiuru Zhang,Muhammad Abdul Rouf,Yoga Mahendra,Lin Wen,Yan Li,Xiaojuan ZhangLi Li,Luming Wang,Tao Zhang,Guixue Wang,Yeqi Wang,Noncanonical protease-activated receptor 1 regulates lymphatic differentiation in zebrafish, 2021

● 服務案例8. klf6a-tagln2軸通過調節(jié)內皮細胞重排和肌動蛋白細胞骨架動力學來驅動斑馬魚血管修剪

研究背景：血管重構是血管生理和病理的關鍵。由血管生成形成的原始血管叢，隨后經過廣泛的血管重構，建立起具有功能和層次的分支血管網絡。

研究目的：進一步了解大直徑血管的修剪。

研究方法：

（1）利用基因編輯技術制備klf6a/tagln2 mut和KI品系；

（2）三卡因0.06 mg/ mL處理至72 hpf；

（3）斑馬魚胚胎的延時實時成像；

（4）計算紅細胞流動速度

研究結論：發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎尾靜脈叢的腹側毛細血管被修剪成大直徑的尾靜脈血管，klf6a-tagln2軸通過促進內皮細胞重排列和連接重構來調控血管修剪。

研究成果出處：Lin Wen, Tao Zhang, Jinxuan Wang, Xuepu Jin, Muhammad Abdul Rouf, Desha Luo, Yuan Zhu, Daoxi Lei, Hans Gregersen, Yeqi Wang, Guixue Wang. The blood flow-klf6a-tagln2 axis drives vessel pruning in zebrafish by regulating endothelial cell rearrangement and actin cytoskeleton dynamics，2021

● 服務案例9.BDE-99通過轉錄因子six7破壞斑馬魚幼蟲的光感受器模式

研究背景：多溴聯(lián)苯醚 (PBDEs)在水，室內空氣，和日常食物中均可檢測到，其暴露與糖尿病肥胖和神經發(fā)育缺陷等代謝性疾病密切相關。BDE-99是商用多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)主要成分(占42-48%)。視覺障礙是一種標志性的新興毒理學效應，多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)會損害斑馬魚的視力發(fā)育，甲狀腺激素(TH)信號傳導被懷疑是主要貢獻者，six7在硬骨魚的MW 錐體分化中發(fā)揮了重要作用，而外源性T3處理可以顯著抑制six7的表達。這表明其與TH之間的潛在關系。

研究目的：通過對six7在感光器圖案化過程中的調節(jié)作用，研究PBDEs 視覺毒性的機制。

研究方法：在BDE-99濃度量化后，進行斑馬魚的視覺引導的行為測試。通過RNA 提取和、qRT-PCR 分析、冷凍切片和 H&E 染色以及斑馬魚中 six7 表達的敲除和過表達來進行研究。

研究結論：

（1）BDE-99 會損害視網膜中的多個光感受器，并在受精后 120 小時干擾斑馬魚幼魚色覺引導的行為；

（2）光感受器的損傷無法通過引入TH受體拮抗劑來*恢復改變，這表明其他潛在調節(jié)因素的參與；

（3）通過調節(jié)中波長視蛋白的關鍵誘導劑 six7 的表達，我們證明了在 BDE-99 的破壞中，是 six7 而不是 THs主導了感光器圖案化。該工作促進了對 six7 在感光器圖案化過程中的調節(jié)作用的理解，并提出了 PBDEs視覺毒性的新機制。

研究成果出處：Wei S, Chen F, Xu T. BDE-99 Disrupts the Photoreceptor Patterning of Zebrafish Larvae via Transcription Factor six7 . 2022