異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC） 
純品為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構體，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，zui大吸收光波長為490～495nm，zui大發(fā)射光波長為525～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應用zui廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。 
FITC 是在熒光素的基礎上通過化學反應增加硫氰酸基團得到的，硫氰酸基團可以和生物活性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團反應形成硫脲鍵，從而實現(xiàn)對生物活性物質(zhì)的熒光標記。在堿性條件下（pH8.5以上），F(xiàn)ITC的異硫酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個Ig分子上zui多能標記15~20個FITC分子。

FITC標記抗體流程： 
（1）將待交聯(lián)的蛋白（濃度≥1mg/ml）對交聯(lián)反應液透析三次4℃，至pH=9.0。交聯(lián)反應液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。 
（2）將FITC溶于DMSO中，濃度為1mg/mL。每次交聯(lián)使用的FITC均應新鮮配制，避光。 
（3）按P:F（蛋白質(zhì):FITC）=1mg:150μg 的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻，暗處4 ℃反應8 h。 
（4）加入5mol/L的NH4Cl至終濃度50mmol/L，4 ℃終止反應2 h。 
（5）將交聯(lián)物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。 
（6）交聯(lián)物的鑒定 
蛋白濃度（mg/mL） = [ A280– 0.31×A495 ] / 1.4 
F/P比例: 3.1×A495 / [A280 – 0.31×A495 ]，該值應介于2.5 ~ 6.5之間。 
（7）FITC交聯(lián)的蛋白應置于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。 儲存條件：4℃避光保存 

當FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應時，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵（thiocarbmide）結合，形成FITC-蛋白質(zhì)結合物，即熒光抗體或熒光結合物。一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般zui多能結合15～20個，一個IgG分子可結合2～8個分子的FITC，其反應式如下 
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白質(zhì) → FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhì) 
常用Marsshall（1958）法標記熒光抗體，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標記法或Clark等（1963）的透析標記法。 
1．Marsshall法 
（1）材料 抗體球蛋白溶液、0．5mol／L（pH9．0）碳酸鹽緩沖液、無菌SPSS、異硫氰酸熒光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 
（2）方法及步驟

①抗體的準備 取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人SPSS及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上（速度適當以不起泡沫為宜）5～10min。 
②熒光素的準備 根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量。 
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。 
b．總蛋白量（AXB）＝Crag。 
c．C／20～C／10＝Dmg（如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20）。 
d．熒光素FITC的量：（1／50～2／100）XC＝Emg。 
e．巳0．5mol／L（pH9．5）碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml。 
f． PBS量D-（B+F）=Gml。 
注：A為蛋白含量，mg／ml；B為蛋白質(zhì)溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數(shù)，mg；正為熒光素的量，mg；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml。 
③結合（或標記） 邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁（大約在5—10min內(nèi)加完），加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。 
④透析 結合完畢后，將標記的球蛋白溶液離心（2500r／min）20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8．0緩沖鹽水透析（0～4~C）過夜。 
⑤過柱 取透析過夜的標記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7．2）；過濾量：12ml標記蛋白液（過濾前未透析）；收集量：20ml（稀釋1．7倍左右）。 
2．Chadwick法 
（1）試劑和材料

抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無菌吸管，無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml）透析袋等。 
（2）方法及步驟 ①抗體準備 用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nèi)，放于冰槽中。 
②熒光色素準備 按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0．01rug計算，稱取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解。 
③將準備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在o～4~C冰箱中結合（在磁力攪拌機上持續(xù)攪拌）18～24h。 
④透析和柱層析 方法同Marsshall法。 
3．改良法 
（1）試劑和材料

①0.01mol／L（pH7.2）PBS配法中，校定pH至7.2。NaCi 18g、Na2HP04 1.15g，溶于2000ml蒸餾水 
②0.5mol／L（pH9.0）碳酸鹽緩沖液配法 取0.5mol／LNazCOs（5.3％）10ml加入0.5mol／LNaHC03（4.2％）90ml，混合后，校定pH至9.0。 
③3％碳酸鈉水溶液配法 稱L 5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。 
④其他試劑和材料 l％NaN3、離心機及離心管、燒杯（25m1）、攪拌器、無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500m1）透析袋等。 
（2）方法及步驟

①取價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0.15mol／LNaCl）及緩沖液（0.5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9.0）稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃。 
②加入異硫氰酸鹽（FITC）熒光素[蛋白：熒光素＝（50—80）mg‘lmg]，在0～4~C 
下電磁攪拌12～14h。 
③然后用半飽和的硫酸銨將標記球蛋白沉淀分離，除去未結合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler試劑測驗，至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止）。 
④將制備好的熒光抗體加NaN30.01％，分裝在lml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，一20~C保存可達2年以上。 
4．透析標記法

此法適用于小量抗體的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。 
（1）試劑和材料

試劑和材料同改良法。 
（2）方法及步驟

①用0.025mol／L碳酸鹽緩沖液pH9．0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1％濃度，裝入透析袋中。 
②用同一緩沖液將FITC配成0.1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。 
③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4~C電磁攪拌下透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用SephadexG50凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝，貯存于4℃中。