鼠尾膠原蛋白

	鼠尾膠原蛋白 I型(rat tail tendon collagen type I)是通過 Birkedal-Hansen1 的方法，通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備的。 鼠尾膠原蛋白可用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)一些在普通細(xì)胞培養(yǎng)器皿中不易貼壁的細(xì)胞。也可用于制備三維膠，模擬真實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境，使細(xì)胞在三維環(huán)境中生長(zhǎng)。
使用 Birkedal-Hansen1的方法，通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備。 在 1mg/ml 濃度以上可形成具有一定強(qiáng)度的三維膠，可用于細(xì)胞的三維空間培養(yǎng) 。 通過在包被的培養(yǎng)器皿中培養(yǎng) PC-12 細(xì)胞、在三維膠原中培養(yǎng) NIH-3T3 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制 。 電泳結(jié)果和 Sigma 的同類產(chǎn)品無顯著區(qū)別 。 產(chǎn)品為無菌的溶液，省去從干粉配制的麻煩 。 在無塵車間中生產(chǎn)，保證潔凈度 。

使用方法：

1、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被 *濃度： 1-5ug/cm²

以包被濃度為 2 ug/cm² 為例：用無菌0.006mol/L(0.36g/L) 乙酸將膠原蛋白稀釋到0.012mg/ml。按表 (一)體積加到相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中：

表 (一)

確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺(tái)上過夜晾干。 也可以在室溫放置 1小時(shí)后，用PBS洗3-4次后直接使用。

包被好的器皿在 4-25℃至少可保存3個(gè)月以上的時(shí)間。

2、三維膠原的制備

鼠尾膠原蛋白I型在濃度1mg/ml以上，pH 7左右時(shí)可形成具有一定強(qiáng)度三維膠,建議成膠濃度1-2mg/ml。膠原蛋白溶解于0.006mol/L 乙酸中，在成膠過程中需要加入0.06X 體積的 0.1mol/L NaOH 來中和。

需要的溶液 ( 均需要 無菌 、 預(yù)冷 ): 10xPBS( 可含10 mg/L的酚紅用于 pH 指示 )或 10x 培養(yǎng)液 , 0.1mol/L NaOH, 0.1mol/L 乙酸(一般不用), 雙蒸水

A．不含細(xì)胞的三維膠原的制備（以配制1毫升，1mg/ml三維膠為例）：將200ul鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml)加到置于冰浴的離心管中，加入690ul H2O。然后加到12ul 0.1mol/L NaOH中（如果反過來把12ul 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻。再加入100ul 10xPBS或10x培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中(混勻后pH為7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試)。將培養(yǎng)器皿在室溫(25度左右)下放置20分鐘待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。如果配制中使用的是10xPBS，使用前需要加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)平衡。

B．含細(xì)胞的三維膠原的制備（以配制1毫升，1mg/ml三維膠為例）：準(zhǔn)備好懸浮于培養(yǎng)液的細(xì)胞，并放置于冰浴中。將200ul鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml)加到12ul 0.1mol/L NaOH中（如果反過來把12ul 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中，會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻。再加入23ul 10xPBS或10x培養(yǎng)液，混勻(混勻后pH為7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時(shí)需要用pH試紙測(cè)試)。加入760ul的細(xì)胞懸浮液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。將培養(yǎng)器皿在室溫下放置20分鐘待膠凝固后，加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注：鼠尾膠原蛋白I型在室溫下pH中性時(shí)可迅速成膠，在操作過程中要盡量保持低溫。