提到這一類的實驗，想必很多實驗室的同胞們會對其設(shè)計、操作和結(jié)果分析感到十分困惑：如何保證劃痕的均勻一致？結(jié)果如何分析？為什么每次實驗的重復(fù)性很差？其實，當(dāng)大家沉浸在劃痕實驗的愛與痛中的時候，結(jié)合納米材料與微孔板全自動成像技術(shù)已經(jīng)占領(lǐng)3D世界的Wound healing assay了！

對于如何實現(xiàn)3D培養(yǎng)水平的損傷修復(fù)實驗，先不談實驗技術(shù)本身，我們來確認(rèn)一下這種模型的意義，大家都知道，Scratch assays本身是為了評估細(xì)胞的損傷修復(fù)和遷移的能力，而生物體內(nèi)真實的損傷修復(fù)都是在極為復(fù)雜的細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下進行的，可以理解為，真實的細(xì)胞生長的環(huán)境是一個多民族聚集的三次元大家庭，而不是現(xiàn)在我們大多數(shù)實驗條件限制下構(gòu)建的二次元模型。因此，如果采用3D培養(yǎng)細(xì)胞模型來進行損傷修復(fù)實驗，才能夠獲得更加貼近體內(nèi)的研究的實驗結(jié)果，避免許多彎路。

那么各位一定和我一樣有這樣幾個問題：3D培養(yǎng)模型應(yīng)該很難構(gòu)建吧？如何方便的檢測3D細(xì)胞培養(yǎng)模型？能快速實現(xiàn)結(jié)果定量分析嗎？對于這些技術(shù)層面的問題，BioTek都有輕松的解決方案。

Q1：如何實現(xiàn)3D細(xì)胞woundhealing模型的構(gòu)建？聽起來不簡單?。?/span>

伴隨著材料學(xué)的進步，通過n3D公司的基于納米材料的“磁力懸浮”系統(tǒng)構(gòu)建體外3Dwound healing模型，這種模型構(gòu)建方式的優(yōu)勢是3D成球速度非?？欤拘枰獢?shù)天甚至數(shù)周以上的模型構(gòu)建周期，如果采用磁力懸浮系統(tǒng)，僅需15分鐘至數(shù)小時即可構(gòu)建。操作方法的示意圖見下圖所示：

圖1：”磁力懸浮系統(tǒng)”構(gòu)建3Dwoundhealing模型示意圖。A，加入生物親和性的納米材料磁化細(xì)胞。B，將磁化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至頂部帶有磁子的6孔板中使其懸浮自然形成胞外基質(zhì)（ECM）。C，形成胞外基質(zhì)的細(xì)胞體系轉(zhuǎn)移至底部具有環(huán)形磁子的384/96孔Woundhealing模型培養(yǎng)板中培養(yǎng)數(shù)小時。

由此可見，采用這種磁力懸浮系統(tǒng)，能夠快速有效的構(gòu)建形成胞外基質(zhì)的3D損傷愈合模型。生命科學(xué)的研究往往是從量變到質(zhì)變的積累突破，只有樣本量達到一定的數(shù)量，我們才能獲得有效的實驗結(jié)果，之前我們可能認(rèn)為培養(yǎng)數(shù)個3D細(xì)胞球已經(jīng)很難了，更何況是要進行多個樣品重復(fù)，評估多種藥物/化合物或刺激因素呢？而我們這里介紹的這個模型，恰好非常有效地解決了樣本通量的問題。

Q2：3D模型雖然很好，但是不好檢測啊，有人用Confocal拍一個3D細(xì)胞球都要好幾個小時，這幾十上百個的，如何獲得結(jié)果？

這個問題，就要輪到大名鼎鼎的Cytation^TM系列多功能細(xì)胞成像檢測儀登場（詳細(xì)介紹請回顧公眾號歷史消息）。Cytation^TM成像模塊的特點就是，“想怎么拍，就怎么拍”，無論我們是想拍小視頻、多視野拼圖、多色熒光疊、Z-軸層切、無固定視野多孔拍攝等等，Cytation^TM都只需要一個簡單的程序就能一次搞定，還能讓你實現(xiàn)任意時間的活細(xì)胞自動監(jiān)測，是不是很方便？像今天介紹的這種3Dwound healing模型，我們需要對每個細(xì)胞團清晰成像，還能在不同時間點成像，這樣能夠更全面的評估損傷愈合的過程（圖2，3）。

圖2：Cytaiton對不同時間點3D培養(yǎng)的未給藥組模型損傷愈合情況自動拍攝的圖像。4X物鏡，相差成像。

圖3：Cytaiton對不同時間點3D培養(yǎng)的給藥組（cytochalasin D）模型損傷愈合情況自動拍攝的圖像。

以上兩張圖清晰地展示了無藥物處理的3D細(xì)胞模型，每隔一定時間成像檢測結(jié)果顯示所有細(xì)胞逐漸向中心區(qū)域遷移，使這個環(huán)形“傷口”逐漸向中心愈；而使用了細(xì)胞松弛素D的模型組，環(huán)狀的3D 細(xì)胞團不再向中間生長，提示損傷修復(fù)功能受到抑制。

除了相差或明場的觀測，如果我們想要評估多種細(xì)胞混合培養(yǎng)以后，每種細(xì)胞的遷移或增殖速度，就需要用到熒光標(biāo)記或熒光蛋白轉(zhuǎn)染的方法了，由于Cytation可以自動對多通道熒光疊加成像，我們也可以在此模型基礎(chǔ)上進行更多的研究。

圖4：Cytation^TM熒光成像通道展示表達RFP的成纖維細(xì)胞在共培養(yǎng)3D wound healing模型中的分布。

Q3：光有圖片怎么行？我們需要用數(shù)據(jù)來說話，這個模型如何進行圖像定量分析？

從前面可以看出，基于磁力懸浮系統(tǒng)構(gòu)建的3D woundhealing模型，是通過評估環(huán)形3D細(xì)胞球的細(xì)胞向中心遷移的程度來反應(yīng)損傷愈合的過程，隨著細(xì)胞遷移，環(huán)形3D細(xì)胞球的總面積減少。因此，我們需要從圖片上獲得環(huán)形3D細(xì)胞球總面積的實時變化。Cytation^TM檢測平臺系統(tǒng)的控制及分析軟件Gen5，帶有多種靈活的圖像分析功能，包括細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞面積、細(xì)胞周長、細(xì)胞亞群分析、多Mask圈選、多種曲線擬合等功能。在進行圖像分析時，同樣只需要編輯數(shù)個分析步驟，即可對整個實驗中每個時間點的圖像進行分析。因此，即使是384孔板的N個時間點的圖像，Gen5軟件也能快速自動化幫大家得到分析結(jié)果。

圖5，Gen5軟件展示對3Dwoundhealing模型的分析結(jié)果。AB，給藥組及對照組樣品細(xì)胞金色輪廓Mask圈選，統(tǒng)計總面積。右上，每隔30mins，連續(xù)監(jiān)測16h的不同給藥濃度條件下，對HT1080細(xì)胞3D模型的損傷修復(fù)曲線。右下，16h后，CytochalasinD的損傷修復(fù)抑制作用的Dose-Response曲線及IC50值（可點擊放大圖片查看）。

圖5非常棒的展示了Gen5強大的圖像分析運算能力，右上角的動力學(xué)損傷愈合曲線，每個點代表一個時間點的一張圖像的分析結(jié)果，而評估一個化合物一般需要8個濃度梯度，一共32個時間點，因此這一個實驗需要分析256張以上的圖像，如果再做重復(fù)樣品，則需要更大的樣品分析量。如果沒有Cytation^TM和Gen5軟件的強強聯(lián)合，恐怕這樣的實驗設(shè)計，我們早已望而卻步啦。而現(xiàn)在，我們不但有基礎(chǔ)的動力學(xué)曲線，還能輕松獲得每個藥物的EC/IC50，提供嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乃帉W(xué)研究實驗數(shù)據(jù)，無需將大量的數(shù)據(jù)樣本在不同的分析軟件中來回轉(zhuǎn)移。

對于整個實驗，大家關(guān)心的三個問題，在Cytation&Gen5的聯(lián)合出擊下，都應(yīng)迎刃而解，而需要你做的，就是動用聰明的大腦，去設(shè)計更多有趣、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒烅椖?，而不用?dān)心耗費大量的時間和精力，去做重復(fù)性的勞動來進行圖像捕獲及數(shù)據(jù)分析。