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高通量蛋白相互作用分析方法匯總
閱讀：41 發(fā)布時間：2023-1-6
作為生物體的重要組成部分和生命活動的重要物質(zhì)基礎，蛋白質(zhì)幾乎參與了所有的生命活動，包括生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝、免疫反應、信號轉(zhuǎn)導、催化作用等。因此，研究蛋白-蛋白相互作用，并進一步勾畫出生物體內(nèi)蛋白相互作用網(wǎng)絡，有利于我們更加透徹地理解生命活動基礎。
傳統(tǒng)的免疫共沉淀、GST pull down、Far western blot等生化方法需要進行蛋白免疫印跡檢測，工作量大、時間長，尤其是在進行大規(guī)模蛋白截短篩選或藥物靶點篩選時，更需要配置多塊凝膠進行電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育、曝光，過多的操作步驟會引入更多的影響因素，影響結(jié)果的真實性。
酶標儀可對微孔板進行讀數(shù)，一次檢測可獲得整個孔板的數(shù)據(jù)。利用熒光分子標記待研究蛋白，當該蛋白與另一蛋白發(fā)生相互作用時，熒光會因為蛋白分子運動特性或兩蛋白分子間距離的改變而改變。酶標儀的高級熒光檢測功能能夠識別這種熒光的改變，反映所需研究蛋白是否與其他蛋白發(fā)生相互作用以及這種相互作用的程度。目前，適用于酶標儀的蛋白相互作用檢測方法主要有以下三種：熒光能量共振轉(zhuǎn)移、熒光偏振和alpha篩選。
一、熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）
熒光能量共振轉(zhuǎn)移是較早發(fā)展起來的一門技術，隨著綠色熒光蛋白應用技術的發(fā)展，F(xiàn)RET已經(jīng)成為檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具。
熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強（敏化熒光）。受體熒光強度與供體熒光強度的比值，則反映了兩種蛋白間相互作用的強弱（圖1）
光波可以在任何一個平面上均勻振動。當其通過某個平面時，有可能受到平面作用將光波分成不均勻光束?？赡茉谀骋粋€方向上的振動強度強或弱于其他方向的振動強度，這種光稱為偏振光。（圖2）
AlphaScreen系統(tǒng)含有兩種核心物質(zhì)，一種為Donor Bead，另一種為 Acceptor Bead，當 Donor Bead所帶有的A分子與Acceptor Bead所帶有的B分子產(chǎn)生交互作用時，可以680nm激光去激發(fā)Donor Bead表面所帶有的光敏感物質(zhì)，使其催化周遭的氧分子形成活化態(tài)，此活化態(tài)的氧分子可與鄰近的Acceptor Bead產(chǎn)生化學冷光化反應，并進一步由能量轉(zhuǎn)換激發(fā)Acceptor Bead所帶有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生520-620 nm的熒光信號，反映A、B兩分子是否發(fā)生相互作用以及相互作用程度。（圖4）
利用酶標儀進行高通量分子互作篩選，能夠大大提高靶向藥物、蛋白功能域篩選效率，并反映出目標分子的濃度。這將大大加快生命科學研究過程中人們認識完整信號轉(zhuǎn)導通路的速度，并幫助找到信號通路關鍵節(jié)點的關鍵干預位點，加快生命科學研究成果向醫(yī)學應用的轉(zhuǎn)化。
傳統(tǒng)的免疫共沉淀、GST pull down、Far western blot等生化方法需要進行蛋白免疫印跡檢測，工作量大、時間長，尤其是在進行大規(guī)模蛋白截短篩選或藥物靶點篩選時，更需要配置多塊凝膠進行電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育、曝光，過多的操作步驟會引入更多的影響因素，影響結(jié)果的真實性。
酶標儀可對微孔板進行讀數(shù)，一次檢測可獲得整個孔板的數(shù)據(jù)。利用熒光分子標記待研究蛋白，當該蛋白與另一蛋白發(fā)生相互作用時，熒光會因為蛋白分子運動特性或兩蛋白分子間距離的改變而改變。酶標儀的高級熒光檢測功能能夠識別這種熒光的改變，反映所需研究蛋白是否與其他蛋白發(fā)生相互作用以及這種相互作用的程度。目前，適用于酶標儀的蛋白相互作用檢測方法主要有以下三種：熒光能量共振轉(zhuǎn)移、熒光偏振和alpha篩選。
一、熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）
熒光能量共振轉(zhuǎn)移是較早發(fā)展起來的一門技術，隨著綠色熒光蛋白應用技術的發(fā)展，F(xiàn)RET已經(jīng)成為檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具。
熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強（敏化熒光）。受體熒光強度與供體熒光強度的比值，則反映了兩種蛋白間相互作用的強弱（圖1）
圖1 熒光能量共振轉(zhuǎn)移原理示意圖
二、熒光偏振（Fluorescence Polarization，F(xiàn)P） 光波可以在任何一個平面上均勻振動。當其通過某個平面時，有可能受到平面作用將光波分成不均勻光束?？赡茉谀骋粋€方向上的振動強度強或弱于其他方向的振動強度，這種光稱為偏振光。（圖2）
圖2 偏振光示意圖
熒光分子在受到偏振光激發(fā)時，如果分子保持靜止，該分子將發(fā)出固定偏振平面的發(fā)射光（發(fā)射光仍保持偏振性）。然而，如果分子旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)，那么發(fā)射光的偏振平面將不同于初始激發(fā)光的偏振平面。為了檢測A、B兩種蛋白間是否有相互作用，可使用熒光素標記A蛋白，單獨的A蛋白分子小，旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)速度快，因此偏振光激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射光偏振程度低；當A蛋白與B蛋白發(fā)生相互作用時，形成大分子，運動相對較慢，因此偏振光激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射光偏振程度較高。利用酶標儀檢測發(fā)射光偏振改變程度，能夠估計A、B兩種蛋白相互作用強弱。（圖3）圖3 熒光偏振原理示意圖
三、Alpha篩選(AlphaScreen)AlphaScreen系統(tǒng)含有兩種核心物質(zhì)，一種為Donor Bead，另一種為 Acceptor Bead，當 Donor Bead所帶有的A分子與Acceptor Bead所帶有的B分子產(chǎn)生交互作用時，可以680nm激光去激發(fā)Donor Bead表面所帶有的光敏感物質(zhì)，使其催化周遭的氧分子形成活化態(tài)，此活化態(tài)的氧分子可與鄰近的Acceptor Bead產(chǎn)生化學冷光化反應，并進一步由能量轉(zhuǎn)換激發(fā)Acceptor Bead所帶有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生520-620 nm的熒光信號，反映A、B兩分子是否發(fā)生相互作用以及相互作用程度。（圖4）
圖4 Alpha篩選原理示意圖
當然，包括Alpha篩選在內(nèi)的多種分子互作檢測技術不僅能夠用來反映分子間相互作用，還可以通過競爭結(jié)合檢測目的分子濃度。cAMP作為第二信使，在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中具有重要作用。反應體系中Donor Bead包被了親和素，用來偶聯(lián)化的cAMP，Acceptor Bead表面為anti-cAMP抗體?；腸AMP能夠?qū)onor Bead與Acceptor Bead距離拉近，單體氧分子能夠傳遞至Acceptor Bead，發(fā)生化學反應，轉(zhuǎn)化成光信號。當細胞裂解液加入反應體系時，胞內(nèi)游離的cAMP與標記的cAMP競爭性結(jié)合抗體，熒光強度降低，間接反映細胞裂解液中游離cAMP濃度。利用酶標儀進行高通量分子互作篩選，能夠大大提高靶向藥物、蛋白功能域篩選效率，并反映出目標分子的濃度。這將大大加快生命科學研究過程中人們認識完整信號轉(zhuǎn)導通路的速度，并幫助找到信號通路關鍵節(jié)點的關鍵干預位點，加快生命科學研究成果向醫(yī)學應用的轉(zhuǎn)化。