Brookfield博勒飛粘度計|干燥失重法檢測食品中微生物（單細(xì)胞酵母）的生長

導(dǎo)讀

本項研究提供了一種利用Brookfield博勒飛粘度計基于干燥失重法的生物活性測試方法，為食品行業(yè)擴(kuò)展了微生物檢測范圍的全新視角。

第

一

背 景

20世紀(jì)以來，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)變得更加工業(yè)化和機(jī)械化，食品的保存和防腐是長距離運輸過程中最重要的工作。罐裝、巴氏殺菌和真空密封等方法常被用來延長食品在運輸過程中的保質(zhì)期。但是實踐證明，這些方法是不完善的。在過去的一個多世紀(jì)里，許多消費者都曾患過因食物變質(zhì)而引發(fā)的疾病。食源性疾病是由微生物污染引起的，污染源包括大量的寄生蟲、真菌、細(xì)菌甚至病毒。當(dāng)任意一種微生物污染源被人類誤食后，他們將在人體內(nèi)迅速復(fù)制和繁殖，并引發(fā)疾病，嚴(yán)重的情況下甚至?xí)?dǎo)致死亡。

今天，我們有更嚴(yán)格的政府監(jiān)督和持續(xù)的微生物檢測，以確保我們70億消費者的食品安全。這些測試方法包括：選擇性培養(yǎng)、各種微觀測試或光譜學(xué)測試、酶聯(lián)分析和上市前的基因篩查等。然而，盡管我們有如此多的檢測方法，食源性疾病仍然是一道公共衛(wèi)生風(fēng)險。關(guān)于雞肉、生菠菜、寵物食品等食品的細(xì)菌污染和產(chǎn)品召回報告仍然能在我們的集體意識中引起共鳴，并促使食品工業(yè)和政府機(jī)構(gòu)尋求更好的方法來檢測和預(yù)防微生物污染。

除了病毒以外，大多數(shù)食源性微生物都有一個共同的生命進(jìn)程：進(jìn)食，生長或復(fù)制，產(chǎn)生廢物。事實上，呼吸對于生物完成這一生命進(jìn)程是的，盡管有一些微生物在缺氧（厭氧呼吸或發(fā)酵）的情況下也能完成。有氧呼吸描述的是在有氧條件下從復(fù)雜的有機(jī)分子（如糖、脂肪或蛋白質(zhì)）中釋放能量的過程。在這一過程中，二氧化碳和水蒸氣作為副產(chǎn)物被釋放出來，有機(jī)體會損失質(zhì)量（或重量）。質(zhì)量的損失不僅來源于水分的釋放，更重要的是碳由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)的二氧化碳所帶來的損失。

根據(jù)所有生命體在呼吸過程中都會經(jīng)歷質(zhì)量損失的特性，理論上可以使用質(zhì)量損失的方法測量生物活性。由于大多數(shù)人類病原體的生長溫度為37℃（人體溫度），因此可以在此溫度下培養(yǎng)受污染的食品樣品，并測量質(zhì)量損失率。我們可以使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法來實現(xiàn)這一點，定期對樣品進(jìn)行稱重，以跟蹤質(zhì)量損失率，并與對照樣品（同樣的樣品，但沒有污染）進(jìn)行對比分析。為了驗證這一假設(shè)，我們使用干燥失重水分分析儀（Computrac MAX 4000XL）和附加的濕度空氣泵進(jìn)行模擬測試。濕度空氣泵可以使樣品處于受控的濕度范圍；MAX 4000XL能夠保持樣品的溫度，在較長的時間內(nèi)提供準(zhǔn)確的重量損失讀數(shù)，并且還可以測量氣體流量（濕度空氣）。大多數(shù)食源性病原體由細(xì)菌（如大腸桿菌、鼠傷、肉毒梭菌等）組成，我們在此次AZI實驗室選擇了一種常見的面包酵母，釀酒酵母作為研究對象。這種酵母是一種生長速率相對較快的單細(xì)胞酵母（繁殖時間為90min），通常作為面包和糕點的發(fā)酵劑。它在性質(zhì)上是無害的，不是人類病原體，但與某些致病酵母（如白色念珠菌）具有相似的生理學(xué)特性。

在本研究中，我們首先使用離體測試方法，通過測量接種酵母的的失重數(shù)據(jù)來驗證該方法的可行性，然后使用類似的方法對真實的食品進(jìn)行分析測試。

實驗室粘度計

該項研究提供了一種基于干燥失重法的生物活性測試方法，為食品行業(yè)擴(kuò)展了微生物檢測范圍的全新視角。這種方法并非要取代任何一種傳統(tǒng)的檢測方法，而是希望在食品安全的質(zhì)量檢驗過程中增加一種新的檢測方法。由于本研究中專門研究了釀酒酵母的發(fā)酵特性，因此這種方法在確定某些酵母在面包或釀酒行業(yè)的可行性方面特別有用。傳統(tǒng)的光譜法只能通過光密度表征酵母的種群密度，不能進(jìn)一步說明他們的碳排放能力。

第

二

原料準(zhǔn)備 - 培養(yǎng)基制備和酵母培養(yǎng)

2. 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）是一種半固體培養(yǎng)基，通常用于實驗室真菌培養(yǎng)。瓊脂是一種海藻提取物，具有與凝膠相似的硬度，由纖維素取代蛋白質(zhì)組成（明膠）。由于瓊脂不含蛋白質(zhì)，因此可以在121℃下進(jìn)行消毒，并且仍然保持凝結(jié)性能，而不像明膠在這個溫度下會變性。需要重點注意的是，當(dāng)微生物在瓊脂上生長時，瓊脂本身不會被消耗掉，它只是一個支架，用來保留與之混合的液體營養(yǎng)液（本研究中指的是PDB）。
3. 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液
4. 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液是將去皮的馬鈴薯燉煮，并以正確的比例添加葡萄糖，制備的一種可以被真菌使用的營養(yǎng)液。單細(xì)胞酵母可以在這種液體培養(yǎng)基中以點細(xì)胞懸浮液生長，這種培養(yǎng)方式被稱為液體培養(yǎng)。
5. 澆注瓊脂板
6. 在本實驗中，我們選用直徑為5英寸的平底樣品盤作為培養(yǎng)皿（或聚苯乙烯培養(yǎng)皿），在121℃下消毒30min后待用。從烘箱中取出熔化的PDA混合物，將其放置在500ml的錐形燒瓶中冷卻至約50℃，燒瓶瓶口輕微打開。在無菌工作臺內(nèi)，移取30ml冷卻的PDA培養(yǎng)基，倒入無菌的空白培養(yǎng)皿中，然后用熱消毒鍋的鋁制樣品盤（4000 XL樣品盤）覆蓋每個培養(yǎng)皿，以防止污染。待PDA凝固后，使用密封條將蓋子和培養(yǎng)皿密封，防止水分過度流失，并將其存放在4℃的冰箱中。
7. 釀酒酵母液體培養(yǎng)
8. 移取部分PDB用于培養(yǎng)釀酒酵母（7g/包）。將100ml PDB和約3.5克凍添加到經(jīng)熱滅菌的500ml燒杯中，并在無菌條件下攪拌混勻。在2小時內(nèi)，每隔30min周期性地攪拌混合液，然后將其存儲在4℃冰箱中，以備后續(xù)使用。
9. PDA培養(yǎng)基上接種釀酒酵
10. 液體培養(yǎng)基中的酵母經(jīng)過大量繁殖，即可接種至PDA培養(yǎng)基上。將一個經(jīng)火焰灼燒消毒的接種環(huán)浸入至液體培養(yǎng)基中，以粘附酵母細(xì)胞，然后均勻地涂布，是酵母分散在培養(yǎng)基表面。每個培養(yǎng)皿涂布三次，以提供足夠數(shù)量的酵母初始種群。將所有接種過的培養(yǎng)皿倒置，以防止蓋子上的冷凝水滴落至平板上并干擾細(xì)胞生長，具體操作方法如下圖所示：

在線粘度計

1. 本實驗使用的是小麥面包，面包片存儲在4℃的冰箱中。在實驗開始前一個小時取出面包片，使其溫度達(dá)到室溫。將對照組的放置在樣品盤上，使用無菌移液器在其表面滴加5滴無菌PDB液體培養(yǎng)基，其中4滴分別分布在面包片的四個角落，剩余1滴在面包片中心。對實驗組的面包片執(zhí)行同樣的操作，與對照組不同的是，我們滴加的是含有酵母細(xì)胞液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的添加方式如下圖：

第

三

機(jī)型選擇

本文采用的儀器（下圖）是美國AMETEK Brookfield公司——MAX 4000XL干燥失重分析儀。

干燥

失重

分析

儀

流變儀

第

四

實驗方法

1. 測試程序
2. 為了實時跟蹤重量損失情況，我們需要將測試時長為2小時的單個測試程序串聯(lián)12次，以提供準(zhǔn)確并持續(xù)的24小時內(nèi)重量損失的數(shù)據(jù)。使用儀器的“WebServer”功能，將儀器與實驗室局域網(wǎng)聯(lián)通，可以幫助測試人員以EXCEL格式將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出并進(jìn)行分析。若儀器啟用“Web Server”功能，當(dāng)關(guān)機(jī)后重新開啟儀器時，需要重新連接局域網(wǎng)并建立新的IP地址。通過“菜單”→“設(shè)置菜單”→“以太網(wǎng)設(shè)置”即可查看儀器的IP地址。
3. 釀酒酵母并不是真正的人類病原體，37℃對酵母的生長條件來說溫度太高，因此我們將溫度下調(diào)至30℃。需要主要的是，儀器屏幕上能夠顯示穩(wěn)定的溫度讀數(shù)，但是在使用前需要通過外接熱電偶溫度探針進(jìn)行校驗，以確保溫度的準(zhǔn)確性。MAX 4000XL在實驗過程中的作用類似于一個培養(yǎng)箱：為酵母生長提供溫度條件，同時在一定時間內(nèi)實時測量重量損失的情況。每個單獨的2小時的測試程序設(shè)置參數(shù)如下：
4. 樣品量：25.0±15.0g
5. 閑置溫度：30℃
6. 測試溫度：30℃
7. 樣品盤稱重：標(biāo)準(zhǔn)
8. 樣品稱重：標(biāo)準(zhǔn)
9. 結(jié)束條件：Time，120min（最長測試時間）
10. 串聯(lián)測試：Yes
11. 由于每個測試程序的輸出結(jié)果默認(rèn)為“水分百分含量”，因此我們創(chuàng)建了一個自定義公式來定義總重量損失百分比。前兩個小時的測試程序不需要這個公式，但是接下來的測試程序則需要用到這個公式，以實時準(zhǔn)確的提供重量損失數(shù)據(jù)。
12. 自定義公式：[ (WI1-WF)/WI1] *100
13. WI1：次測試時樣品的初始重量；
14. WF：當(dāng)前測試程序結(jié)束時樣品重量。
15. 空氣發(fā)生器：提供潮濕的空氣
16. 大多數(shù)食品中都含有大量的水分，根據(jù)樣品大小、水分分布情況、樣品表面狀況以及所處環(huán)境不同，具有各自的蒸發(fā)曲線。為了限度地減少瓊脂培養(yǎng)基和面包片的水分蒸發(fā)，我們將空氣發(fā)生器（DAG）改造成加濕器，如下圖所示。DAG產(chǎn)生的氣流經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)入500ml密閉錐形瓶中，在蒸餾水中鼓泡，形成潮濕氣流，然后經(jīng)過管路進(jìn)入MAX 4000XL的測量室。未連接DAG時，儀器測量室的RH讀數(shù)為10.6%，連接DAG，潮濕氣流進(jìn)入儀器測量室30min后，RH讀數(shù)增加至26.5-30.1%，此時測試溫度為30℃。
17. 最初，MAX 4000XL設(shè)計的氮氣吹掃功能，可以使高揮發(fā)性和潛在爆炸性的樣品在無氧室內(nèi)進(jìn)行測試（防止燃燒或爆炸）。對于這個實驗，儀器的這個功能可以為樣品和在其上生長的酵母提供半潮濕的環(huán)境。
18. MAX 4000XL測試
19. 當(dāng)選擇12個串聯(lián)測試中個測試程序且溫度達(dá)到30℃時，所有的測試程序就緒并依次運行。點擊開始，儀器依次提示稱量樣品盤，在規(guī)定的稱樣范圍內(nèi)稱量樣品（10-40g）。對于PDA樣品（對照樣品和接種樣品），測試時應(yīng)去除培養(yǎng)皿上的蓋子，然后將其向上放置在儀器的樣品盤上面，儀器會識別重量的變化以及是否在可接受范圍內(nèi)。然后提示關(guān)閉保護(hù)蓋，此時測試程序開始運行并持續(xù)24小時。
20. 數(shù)據(jù)分析
21. MAX 4000XL會自動存儲測試數(shù)據(jù)，也可以通過Web Sever功能將原始數(shù)據(jù)以EXCEL格式導(dǎo)出。必須通過剪切和粘貼的方式將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至新的表格中并重新排序，因為導(dǎo)出的報告的數(shù)據(jù)順序與測試順序相反。建立測試方法時自定義的公式只能在儀器屏幕上顯示，數(shù)據(jù)導(dǎo)出后必須在EXCEL表格中重新建立公式進(jìn)行重量損失百分比的計算。公式如下：

質(zhì)構(gòu)儀

1. MAX 4000XL每30秒讀取一次樣品重量和損失速率。但是，當(dāng)一個新的測試開始時，儀器不能立即識別到這是一個鏈接測試，此時重量損失百分比和速率都會下降至零點。如果將前30秒的數(shù)據(jù)保留在結(jié)果序列中，則在生產(chǎn)的圖表中每隔2小時每個測試程序開始時會出現(xiàn)數(shù)據(jù)急劇下降，并影響平均值的計算，因此可以將這段數(shù)據(jù)忽略掉。
2. EXCEL表格中生產(chǎn)圖
3. 在EXCEL表格中使用標(biāo)準(zhǔn)散點圖創(chuàng)建本文結(jié)果部分所示的圖表，縱坐標(biāo)為3次重復(fù)試驗的“總重量損失百分比”平均值，橫坐標(biāo)為測試時間（單位為小時）。實驗過程中的4個變量分別為：
4. 1）PDA（未接種）——對照樣品
5. 2）PDA（接種酵母的實驗樣品）
6. 3）添加了5滴無菌PDB液體培養(yǎng)基的面包片——對照樣品
7. 4）添加了5滴酵母懸浮液的面包片
8. 每個圖表中顯示的誤差線對應(yīng)的是每個變量3次重復(fù)試驗過程中每2小時間隔所取數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)果與分析

1. PDA（未接種）——對照樣品重量損失

本研究的個難點是，必須用數(shù)據(jù)驗證通過重量損失來衡量生物活性的理論的可行性。從一開始我們就知道，將任何樣品放置在MAX 4000XL的測量室內(nèi)，僅靠水分蒸發(fā)就會導(dǎo)致重量損失。因此，我們需要得到一個富含營養(yǎng)的PDA培養(yǎng)基的基準(zhǔn)蒸發(fā)曲線。下圖所示的藍(lán)色曲線即為未接種酵母的PDA培養(yǎng)基的重量損失曲線，測試數(shù)據(jù)來源于三次獨立的重復(fù)實驗。

確定了基準(zhǔn)蒸發(fā)曲線（更準(zhǔn)確地說是總失重百分比曲線）后，我們就可以預(yù)測，如果一個生命有機(jī)體（釀酒酵母）開始在培養(yǎng)基中消耗葡萄糖，便會產(chǎn)生二氧化碳和水分，瓊脂培養(yǎng)基會比對照組的樣品以更快的速率損失重量。盡管我們不能證明二氧化碳和水分是造成重量損失的元兇，但我們?nèi)匀豢梢杂^察到，測試時間達(dá)到8小時后，實驗組樣品的重量損失比例比對照組更高。隨著時間的延長，實驗組的重量損失百分比更高。24小時的測試程序結(jié)束后，對照組樣品的重量減少約6.88%；而接種酵母的實驗組樣品的測試數(shù)據(jù)為11.21%，差距為4.33%。兩組實驗均獨立重復(fù)測試3次，數(shù)據(jù)記錄間隔為2小時。

水分儀

2. 面包片重量損失

當(dāng)確認(rèn)理想條件下重量損失可以衡量生物活性之后，我們將注意力轉(zhuǎn)向一種簡單但實用的食品：面包。面包制作過程中會使用酵母發(fā)酵，本身含有酵母容易吸收和利用的營養(yǎng)物質(zhì)。

如前所述，每種食物類型都有不同的水分釋放特性，因為我們必須首先確定面包的基準(zhǔn)水分釋放曲線，然后與因生物活性而導(dǎo)致的重量損失進(jìn)行比較。由于面包的含水量高，且比瓊脂板表面積大，實驗證明面包的水分蒸發(fā)率比瓊脂板大得多，但是最終會到達(dá)一個平臺期。

在PDA的實驗中，接種酵母培養(yǎng)液不會帶來大量的水分。但是，在面包片實驗中，考慮到面包表面粗糙性，無法使用接種環(huán)進(jìn)行涂布接種。為了在面包上添加更多的酵母，我們直接在面包片上滴加5滴含有酵母的PDB液體培養(yǎng)液（保證酵母開始生長時有足夠的水分）。這5滴培養(yǎng)液給面包片帶來了大量的水分，因此，我們在對照組樣品上也滴加了5滴無菌液體培養(yǎng)液（不含酵母）。在24小時的培養(yǎng)時間內(nèi)，對照組的重量損失率為26.76%；實驗組的重量損失為28.39%，二者相差1.63%。

與PDA實驗相比，實驗組和對照組的差異更小，但考慮到僅僅水分蒸發(fā)就損失了非常多的質(zhì)量，在培養(yǎng)至第14小時后，我們能夠觀察到兩組樣品存在統(tǒng)計學(xué)上的差異。面包片的測試方法與PDA測試方法相同。

粉體流動測試儀

結(jié) 論

精密儀器

基于孵育的食品微生物污染檢測并不是食品安全篩選的新技術(shù)。事實上，選擇性培養(yǎng)和光譜學(xué)方法往往依賴于增加潛在污染形式的物理數(shù)量，以便光譜學(xué)方法可見的感知或檢測范圍。重量損失法作為一種新的方法可以指示食品中微生物的存在，但是首先要了解每種產(chǎn)品的水分釋放基準(zhǔn)曲線。使用這種方法，實驗人員無需使用昂貴的選擇性介質(zhì)或?qū)ｉT的光密度容器，將食品直接放置在MAX 4000XL的測量室內(nèi)，無需任何加工或培養(yǎng)技術(shù)。此外，用戶還可以實時查看水分釋放速率（或重量損失速率）。值得注意的是，我們根據(jù)釀酒酵母的繁殖特點（倍增周期為90min），選擇了24小時的培養(yǎng)周期（溫度為30℃）。如前所述，釀酒酵母不是一種人類病原體，其性質(zhì)類似于細(xì)菌。大腸桿菌是一種常見的食源性細(xì)菌，在理想條件下（37℃），大腸桿菌的倍增周期僅為20min。如懷疑受該細(xì)菌感染，分析人員可以選擇一個相對較短的培養(yǎng)時間，但是通過一些前期工作來確定合適的培養(yǎng)時間。

盡管DAG被改造成加濕器使用，但仍需進(jìn)一步的研究以確定該裝置能否對生長中的生物體施加足夠的水分，但是該裝置可以作為預(yù)防措施，以防止在測試過程中過度干燥。同時，我們也可以使用該裝置填充生長腔提供其他氣體。在本研究中，我們使用的是潮濕的空氣。另外，我們也通過施加潮濕氮氣來觀察厭氧條件下重量損失的情況。經(jīng)過數(shù)次試驗，我們發(fā)現(xiàn)：厭氧條件下，接種酵母的PDA培養(yǎng)基的重量變化與有氧條件下未表現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。這可能與我們選擇的酵母菌株有關(guān)，其在有氧和厭氧條件下均表現(xiàn)良好的適應(yīng)性。有趣的是，在厭氧試驗結(jié)束后，分析人員聞到了輕微的酒精氣味。雖然純屬猜測，但可能表明酵母在這一過程中經(jīng)歷了發(fā)酵，釋放了二氧化碳和酒精（而非水分）。

本研究的數(shù)據(jù)對烘焙和釀造行業(yè)具有特殊的指導(dǎo)作用。除了細(xì)胞計數(shù)以外，也可以通過其他方法來測試酵母種群的生存能力，因為種群的數(shù)量或密度不一定表示培養(yǎng)物的生存能力強(qiáng)大。根據(jù)不同產(chǎn)品的重量損失百分比來確定酵母菌株的生長速率，可能有助于面包師或釀酒師對其產(chǎn)品菌株的選擇。

也許MAX 4000XL的單培養(yǎng)腔可能存在一定的缺點，但是從微生物生長過程中收集的數(shù)據(jù)來看，我們能很好地了解其與食品間的相互作用。另外，一個穩(wěn)定且受控的實驗環(huán)境意味著測試開始后，無需打開蓋子，這樣就可以有效防止溫度和濕度的波動。我們甚至可以在測試結(jié)束后鏈接一個滅菌程序。MAX 4000XL可以設(shè)置高達(dá)275℃的測試溫度，但滅菌程序的溫度設(shè)置為121℃就足以對大多數(shù)的食品進(jìn)行消毒?？偟膩碚f，Computrac MAX 4000XL用于檢測微生物基于呼吸作用的生長情況是非常實用的，為分析人員提供了一種檢測食品中潛在污染物的新的分析方法，幫助我們更好地了解固體和半固體食品中微生物生長和繁殖的實時情況。

MAX 4000XL 小百科

博勒飛粘度計制造商

• 堅固的結(jié)構(gòu)：金屬外殼和鎳鉻合金加熱元件
• 快速冷卻系統(tǒng)：減少測試等待時間
• 氮氣吹掃：市場上允許使用氮氣吹掃的水分分析儀，保證測試過程的準(zhǔn)確性和安全性
• 測試結(jié)束條件：預(yù)測、速率、時間和其他5種組合條件
• 串聯(lián)測試功能：游離水與結(jié)合水測試
• 校準(zhǔn)可溯源至NIST

編者薦語：

2020年1月23日北京德泉公司正式成為BROOKFIELD博勒飛中國總代理,負(fù)責(zé)其品牌的銷售、市場、服務(wù)等工作。BROOKFIELD品牌LAB系列和HEP系列產(chǎn)品包括：粘度計、流變儀、質(zhì)構(gòu)儀、水分儀以及粉體流動測試儀等。

以下文章來源于Brookfield博勒飛 ，作者Brookfield China

Brookfield博勒飛

阿美特克集團(tuán) - 美國博勒飛公司是世界上的實驗室粘度計、在線粘度計、流變儀、質(zhì)構(gòu)儀、水分儀以及粉體流動測試儀等精密儀器的專業(yè)制造商